附录C（资料性附录）　变应原特异性IgE抗体检测—酶联免疫吸附试验（ELISA）

C.1　原理

酶联免疫吸附试验的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，将已知特异性抗原先固定于固相载体表面，形成固相抗原，加入待检样本，再加入酶标记的抗体，使在固相载体上形成抗原-待检抗体-标记抗体复合物，加入酶底物及色原后呈色，呈色程度用吸光度（A）值表示，所测A值与待测变应原的水平呈相关关系。

C.2　器材

多孔聚苯乙烯板（通用的为96孔板，12×8孔）、微量加液器、酶标免疫检测仪、PH试纸、恒温箱、冰箱、洗瓶、湿盒、常用玻璃仪器等。

C.3　试剂

C.3.1　目前各种ELISA试验均有商品化的专用试剂盒。包含已包被羊抗人IgE反应板，系列标准品（0U/mL、10U/mL、100U/mL、500U/mL）及质控血清；酶（HRP）标记抗人IgE单克隆抗体；缓冲液、终止液等。

C.3.2　专用标记用酶：最常用辣根过氧化物酶（horse-radish peroxidase，HRP）标记各种抗体。

C.3.3　常用酶底物与色原：HRP的底物是H₂O₂（或过氧化脲），催化时需供氢体参与，后者多为还原性染料，通过反应生成深色的或有荧光的氧化型染料。HRP可用的色原（供氢体）很多，常用的为邻苯二胺（OPD），3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（TMB），四甲基联苯胺硫酸盐（TMBS）等。H₂O₂（或过氧化脲）与色原常在试验前混合。

C.3.4　包被液（pH 9.6 碳酸盐缓冲液）：Na₂CO₃ 0.16g、NaHCO₃ 0.29g加蒸馏水溶解后补水至100mL，4℃保存。

C.3.5　洗涤液（0.02mL/L、pH 7.4Tris-HCl-Tween 20 缓冲液）：Tris 0.42g，1mol/L HCl 13mL，Tween 20 0.5mL，加蒸馏水至1 000mL。

C.3.6　终止液（2mol/L H₂SO₄）：浓 H₂SO₄ 22.4mL，加蒸馏水 177.6mL。

C.4　方法步骤

C.4.1　自冰箱中取出试剂盒，恢复至室温（18℃～25℃）；配置试剂；稀释待测血清；将所需量的已包被抗人IgE抗体的微孔反应板用洗液洗1次。

C.4.2　加待检血清、不同浓度的IgE标准品至相应微孔中，每孔100μL，室温1h。甩尽孔内液体，用洗涤液洗孔3次，在吸水纸上拍干。

C.4.3　加入工作浓度的酶标记抗人IgE抗体，每孔100μL，室温1h。同上法洗孔。

C.4.4　加入酶底物/色原溶液，每孔100μL，室温避光反应10min～15min。

C.4.5　每孔加终止液50μL，终止反应，30min内于酶联仪相应波长测吸光度值。

C.5　结果判定

C.5.1　参比阴、阳性对照（或称阴、阳性质控品）的吸光度，以P/ N或S/ CO比值报告。

C.5.2　P/N比值 即（待测样本A-空白对照A）/（阴性对照A-空白对照A）。一般以P/N≥2.1为阳性。

C.5.3　S/CO比值 S为待测样本A值，CO为cut-off值，常以阴性对照平均A值×2.1代表CO值。一般以 S/CO≥1.0为阳性。