间充质干细胞( mesenchymal stem cells，MSCs)是一种定向干细胞，在胚胎发育中来源于中胚层，小鼠胚胎发育10天左右出现，之后，几乎分布于机体的所有组织和器官中。成体MSCs主要存在于骨髓、骨膜下、胸腺、脂肪、肌肉等组织中。MSCs具有成骨、成软骨、成神经及成脂肪的能力，在神经损伤、骨骼修复、关节疾病等的治疗和修复中有重要的作用。本节就MSCs与材料结合，在神经修复和骨修复的相关内容进行阐述。

脊髓等中枢神经损伤后再生修复困难，据统计全世界脊髓损伤的年发生率为( 20～40) /100万，中国脊髓损伤人数已突破百万，全球脊髓损伤人数已超过300万。随着交通运输和城市化步伐的迅速发展，脊髓损伤的发病率有不断上升趋势，且常留下肢体瘫痪等后遗症，其高致残性和低龄化的特点给家庭及社会带来沉重的经济负担。脊髓损伤的治疗包括药物、手术、高压氧、康复、细胞移植等措施，干细胞移植是治疗脊髓损伤最具有潜力的方法。神经干细胞( neural stem cells，NSC)是具有自我更新和多向分化潜能的细胞，它能不断增殖，并分化为神经系统主要的细胞类型(神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)，能自我更新并足以提供大量神经组织细胞的细胞。NSC移植已成为目前促进神经损伤修复最有潜力的手段。神经干细胞具备以下特点:①自我维持和自我更新的能力，神经干细胞移植到体内后仍能保持其干细胞特性在体内大量增殖。②一定的增殖、分裂能力。③与脊髓组织同源，容易与新宿主整合重建神经元传导通路。④向神经谱系细胞分化的能力，可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。⑤对疾病或损伤反应的能力，能到达损伤部位并产生新的细胞。⑥免疫原性较低，易基因调控，不存在免疫排斥的问题。⑦通过体外分离、培养，数目能够大量扩增，并且冷冻后可以较长时间的保存。正是由于神经干细胞如此多的优点，使得神经干细胞成为目前干细胞移植治疗脊髓损伤的一种良好种子细胞。神经干细胞具有对称分裂及不对称分裂两种分裂方式，从而保持干细胞的稳定性。通过对称性分裂形成两个相同的子代神经干细胞以使得神经干细胞数目不断倍增;通过不对称性分裂不均匀性分配细胞内活性物质，使得一个子细胞在外界相关因子刺激下不可逆地向分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化，从而获得自我更新，另一个子细胞则保留神经干细胞自我维持的特征。除此之外，骨髓间充质干细胞在特定条件下经诱导可分化为神经干细胞，是治疗脊髓损伤的种子细胞之一。

在深入了解NSC特性以及对于脑组织的修复作用的同时，有必要积极寻求能够促进NSC在移植部位更好地存活并向损伤修复所需的细胞分化的策略。目前基于NSC修饰、NSC体外定向诱导分化后移植、混合细胞共移植以及干细胞—生物材料共移植等的一些尝试取得了比较明显的效果，在一定程度上提高了移植细胞在移植部位存活及分化能力。

脊髓组织工程要素包括生物材料、细胞以及恰当的修饰剂(如细胞诱导分化剂)，通过以上3方面的有机结合，协同作用，可再生重建脊髓，达到修复目的，是近年来研究的热点。实验构建组织工程脊髓以此替代修复脊髓的损伤。随着组织工程的迅速发展，能够促进细胞黏附、生长和分化的生物支架材料的研究日益重要。在人体组织器官中，细胞指导细胞外基质的合成，反过来细胞外基质又提供细胞黏附、爬行、增殖、完成分泌基质等细胞功能的力学和生物化学信息，彼此存在着动态的相互作用。生物支架是对细胞外基质( extracellular matrix，ECM)结构和功能的仿生，起到替代ECM的重要作用，因此细胞支架及其结构将对组织工程脊髓的移植疗效产生重要影响。随着组织工程技术的快速发展，用组织工程技术修复脊髓损伤取得了令人鼓舞的效果，以生物可降解材料为支架进行神经细胞培养的脑组织工程及其在脑组织损伤修复和神经系统重建中的应用成为一新兴的前沿领域。但由于脊髓结构和神经功能的特殊复杂性，如要尽可能地优化提高组织工程脊髓的移植疗效，其细胞支架的结构设计就成为巨大挑战。新型脑组织工程支架材料的开发及生物相容性研究成为这一领域的研究热点之一。脊髓组织工程要素包括生物材料、细胞以及恰当的修饰剂(如细胞诱导分化剂)，通过以上3方面的有机结合，协同作用，可再生重建脊髓，达到修复目的，是近年来研究的热点。

自我更新和多分化潜能是神经干细胞的两大基本特性，然而单纯的NSC移植效果并不理想，用于移植治疗脊髓损伤的神经干细胞分化为神经元的比例很低。提高神经干细胞向神经元分化的比例主要由以下几个方面决定:种子细胞、支架材料、细胞与材料的相容性及相关的诱导因子。随着组织工程的迅速发展，能够促进细胞黏附、生长和分化的生物支架材料的研究日益重要。在人体组织器官中，细胞指导细胞外基质的合成，反过来细胞外基质又提供细胞黏附、爬行、增殖、完成分泌基质等细胞功能的力学和生物化学信息，彼此存在着动态的相互作用，生物支架是对ECM结构和功能的仿生，起到替代ECM的重要作用，因此细胞支架及其结构将对组织工程脊髓的移植疗效产生重要影响。组织工程支架材料能够有效填充组织缺损区域，阻止瘢痕增生，为种子细胞及内源性修复细胞提供栖息场所，改善局部微环境，促进细胞的增殖及向有利方向分化。成为理想的组织工程支架，必须具备以下性能:组织相容性良好，几乎无免疫排斥反应，局部及全身炎症反应轻，对种子细胞及邻近组织无毒性，与邻近组织能很好融合;制备工艺完善，纤维直径及方向具有强的可控性，材料具有更高的孔隙率，为细胞提供更好的生长空间并利于物质交换:可按需制成在特定时间内逐步降解的材料，易于按需塑形，并可按需改善材料的力学性能，在组织再生过程中性能稳定，又能适时被新生组织取代;具有与细胞外基质更为相似的三维拓扑结构，可作为药物、基因、诱导因子的良好载体，通过表面效应、药物作用、基因表达变化等作用使细胞增殖，可诱导细胞向有利方向分化，有利于组织的修复和功能的恢复。

一些研究发现，细胞支架孔径大小是影响骨和血管等组织工程疗效的重要因素之一，而脊髓结构和功能修复更困难，多大孔径的细胞支架更能提高组织工程脊髓的治疗效果仍缺乏实验依据。因此，实验对用于组织工程脊髓的支架孔径进行分析。支架材料的自身性能及其对种子细胞生物行为的影响对脊髓损伤修复效果起到关键作用，纳米技术也在脊髓组织工程中前景广阔。

神经组织工程包括两个方面的基本要素:支架材料和种子细胞。通过研究纳米纤维支架对神经干细胞生物行为的影响，已经证实支架能够促进神经干细胞的增殖。流式细胞技术分析表明纳米纤维膜能够降低神经干细胞的凋亡率。细胞凋亡是细胞在体内外特定的生理或病理性因素诱导下发生的一种自发的、程序化的死亡过程。细胞内的基因直接控制着细胞凋亡的发生和发展。当细胞受到诱导凋亡因素作用后，经有关细胞信号转导系统的传递而激活凋亡基因，细胞发生凋亡;细胞中同时也存在抑制凋亡的基因，对促进凋亡的基因起拮抗作用。正常情况下，促凋亡基因与抑凋亡基因处于动态平衡状态，以维持机体细胞正常凋亡。基因家族是与细胞凋亡关系非常密切的一组基因家族，通过编码的蛋白来发挥诱导或抑制凋亡的作用。其中 bcl-2和 bax是一对正负调节凋亡的基因， bax基因具有促进细胞凋亡的作用， bcl-2基因则能抑制细胞凋亡。Caspase家族是细胞凋亡的主要执行者，可灭活细胞凋亡的抑制物( bcl-2)，水解细胞蛋白质结构，最终导致细胞降解。bax基因具有促进细胞凋亡的作用，bcl-2基因则能抑制细胞凋亡。因此，bcl-2和bax二者表达的相对水平(即bax/bcl-2)是影响细胞凋亡的重要因素，bax/bcl-2越高，细胞凋亡越易发生，否则反之。此外，Caspase家族是细胞凋亡的主要执行者，可灭活细胞凋亡的抑制物( bcl-2)，水解细胞蛋白质结构，最终导致细胞降解。在此过程中，Caspase3是细胞凋亡重要的效应分子，可活化DNA酶，降解染色体，最终引起细胞凋亡。实验采用实时定量PCR实验技术检测了与纳米纤维膜共培养后神经干细胞凋亡基因表达水平的变化，结果表明bcl-2基因表达量明显增加，而bax及Caspase3基因表达量明显下降，纳米纤维膜能够从基因表达水平调节抑制神经干细胞凋亡的发生。

聚羟基脂肪酸酯( polyhydroxy fatty acid esters，PHA)是一类可由微生物合成的具有良好生物相容性的天然生物可降解高分子材料，也是近年来在组织工程中被广泛关注的新型生物材料。由于各PHA材料单体组成的不同，其机械性能和生物相容性也有很大差异。羟基丁酸一羟基己酸共聚酯( poly( 3-hydroxybutyrate-CO-3-hydroxhexanoate)，PHBHHx)是PHA家族中的一员，在生物相容性、生物活性及机械性能方面的性能优良，与多种细胞都具有良好的生物相容性，是近年来在组织工程中被广泛关注的新型生物材料。PHA家族中多个成员，包括PHB、PHBHHx和PHBVHHx均被尝试用于中枢及外周神经的支架材料，其中PHBHHx材料显示出与神经干细胞、神经胶质细胞的良好生物相容性。PHBHHx是PHA家族中具有很好生物相容性的一员，由于其主链含有短链的3-羟基丁酸单体和中长链的3-羟基己酸单体，其机械性能和可加工性能均优于只含有短链单体的PHA材料，如聚羟基丁酸酯( Polyhydroxybuty-rate，PHB)和羟基丁酸-羟基戊酸共聚酯( poly( 3-hydroxybutyrate-CO-3-hydrox-valerate)，PHBV)。但由于PHBHHx的聚酯性质，其表面疏水性强，阻碍了细胞在其表面的贴附生长，不利于细胞的贴附，因此也局限了其应用范围。最近，有研究表明PHBHHx作为NSC体外培养支架材料具有低细胞毒性、与NSC有很好的相容性，并能够诱导NSC向神经元方向分化。据报道，对PHBHHx膜表面的改性处理可以增加NSC在其表面的贴附生长，而且NSC活力明显高于玻璃片表面，细胞保持其原有的多向分化能力;在发生分化的细胞中以βtubulinⅢ阳性的神经元为主。除此之外，研究人员采用的10%FBS降至1%，能够更好地保留NSC原有的增殖能力，使大约70%的细胞仍处于nestin阳性的未分化状态，这部分细胞能够在体内外进一步增殖，一方面为获得足量的移植细胞提供了保证，同时也为其在体内分化成“神经功能重建所需的特定细胞类型”奠定了基础。同样，也有学者通过采用紫外辐照、丝素蛋白修饰等方法对PHBHHx材料进行改性处理，提高了PHBHHx材料与成纤维细胞、血管内皮细胞等的生物相容性。

自组装多肽水凝胶是由研究者设计合成的可支持多种细胞三维生长的RADA16。RADA16是自我互补的两亲性多肽，它有着规则的重复单位:带正电荷的氨基酸残基(精氨酸)和带负电荷的氨基酸残基(天冬氨酸)被疏水性氨基酸残基(丙氨酸)隔开。在RADA16溶液自组装形成纳米纤维的过程中，疏水性的丙氨酸残基隐藏在内部，而亲水的基团由于是交替的带正电荷和负电荷，所以相互形成离子键。大量的结合在一起的多肽分子聚集在一起形成了纳米级纤维，这些纤维相互交织在一起进一步形成含水量超过99%的水凝胶。这种多肽水凝胶支架材料在体内不会引起明显的免疫反应和炎症反应;由于其含水量高，可以让营养物质和氧气运输到其内种植的细胞内;降解时只形成氨基酸，对机体不会产生不良影响。通过在RADA16末端修饰的来自ECM的生物活性模体进行功能化，可模拟细胞在体内的生长环境，以促进不同细胞的黏附生长。例如:源自层粘连蛋白Ⅰ的多肽片段YIGSR和源自胶原Ⅳ的多肽片段TAG-SCLRKFSTM具有促进内皮细胞黏附生长的功能，Genove等通过直接固相法在RADA16末端合成了含有上述模体的功能化自组装多肽水凝胶，并研究其对人主动脉内皮细胞( HAEC)的作用。结果显示与在多肽组装凝胶RADA16培养比较，修饰有模体的功能化自多肽组装凝胶能显著促进HAEC的分化和在基底膜的沉积。

PLGA支架是聚乳酸和羟基乙酸按一定比例聚合而成的生物材料，在体内通过三羧酸循环降解成CO ₂和水，组织相容性好，且可以根据组织修复需要通过改变二者聚合的比例来调节降解速率，还可以根据组织解剖结构制造精确的仿生三维支架结构，目前已被美国食品药物管理局批准使用、已广泛用于组织工程及临床治疗中，适合用于神经等组织工程的细胞支架。组织工程脊髓移植明显促进了大鼠损伤脊髓功能的恢复，且孔径为200～300μm的PLGA支架移植效果显著优于400～500μm的。移植疗效的差异并不是支架影响神经，而是细胞的贴附和增殖数量所致。孔径影响疗效的机制中，除了Krych等发现较小的孔径更有利于脊髓神经轴突再生修复外，还有可能是支架孔径大小直接影响神经干细胞的彼此相对三维空问分布和生长迁移方向，由此影响神经于细胞与宿主脊髓神经细胞的突触信号联系，表现在移植治疗脊髓半切损伤后肢体运动功能恢复的差异。因此，在组织工程脊髓构建中，支架结构对疗效的影响机制需进一步深入分析，设计更合适的细胞支架孔径是必须考虑的因素之一。

此外，由于骨髓间充质干细胞较其他移植细胞具有来源广泛、取材容易、在体外长期培养过程中始终保持多向分化潜能、体内移植反应弱、克服免疫排斥等优点，因此骨髓间充质干细胞是治疗脊髓损伤的种子细胞。传统胚胎来源和脑来源的神经干细胞由于取材困难，并受伦理道德约束，应用受到极大限制。骨髓间充质干细胞最早由Friedenstein等发现，是一种能贴附于塑料培养板表面生长的成纤维样细胞，故称之为间充质干细胞。近年来的研究发现骨髓间充质干细胞在特定条件下经诱导可分化为神经干细胞。而骨髓来源的神经干细胞避免了传统胚胎来源和脑来源神经干细胞的取材困难、伦理、来源有限的束缚，因此目前备受关注，成为神经干细胞移植的一种新来源。但是由于局部微环境不利于移植神经干细胞的存活及向神经元分化，使得神经干细胞移植修复脊髓损伤潜力十分有限。不少学者试图通过神经干细胞联合其他类型细胞共移植或联合相关外源性神经刺激因子的作用以改善其分化、增殖能力，但研究结果表明以上努力不仅不能持续有效地改善和维持神经干细胞的定向分化和增殖能力，也无法克服脊髓损伤后组织囊变和胶质瘢痕的屏障作用。究其原因是由于移植的神经干细胞主要分化为胶质细胞，而极少向神经元分化;胶质细胞形成的胶质瘢痕及其产生的抑制性作用阻碍了轴突再生。因此，探索能够促进移植神经干细胞增殖、定向分化为神经元，并且能够有效抑制脊髓损伤后胶质瘢痕形成的治疗方法是目前需要解决的问题。有实验表明，IKVAV纳米纤维凝胶对骨髓源性神经干细胞有促进增殖作用，并能提高其向神经元分化的比例，这与文献报道相一致，其机制为IKVAV多肽与神经干细胞表面受体LBP110相结合，促进神经干细胞增殖、分化及轴突生长等。

目前骨组织常用的生物材料包括羟基磷灰石、生物衍生骨、珊瑚、多聚乳酸、多聚乳糖酸及胶原等，应用MSCs构建组织工程骨的策略有:①直接将体外培养扩增的MSCs复合到生物材料中，然后植入到骨缺损部位。MSCs在局部损伤微环境和材料本身的骨诱导作用下分化为成骨细胞，并诱导局部和自身迁移到骨缺损部位的MSCs成骨分化。通过破骨细胞、成骨细胞及多种细胞因子的作用，缺损部位逐步矿化、血管化，生物材料被吸收最终形成有功能的骨组织。此过程称为正位成骨或骨缺损区成骨。在MSCs与材料复合过程中可以引入生物因子或骨诱导小分子化合物或Micro-RNA促进骨修复。②利用地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C、BMP-2及BMP-7等作用下，体外诱导MSCs的成骨分化，将MSCs诱导成成骨样细胞后，并大量分泌胞外基质形成骨矿化颗粒，与骨材料复合;或者将MSCs接种到材料中诱导培养，与材料结合并形成骨组织进行移植和骨缺损的修复，利用体外诱导后一直修复，体内成骨快。后一种方法更有效的保留了细胞分泌的胞外基质，保持了细胞直接的通讯，更有利于骨形成。针对细胞移植破坏胞外基质和细胞间链接通讯的缺点，细胞膜片能很好地解决这一问题，与材料复合进行骨缺损的修复也是一种新的策略。③局部或全身应用MSCs。对于小的缺损，可以进行局部精确定位注射高浓度的MSCs到缺损或病变部位，依靠局部微环境的作用使得MSCs进行成骨分化，参与骨重建。同时由于MSCs的低免疫原性，可用异体正常MSCs静脉注射，通过免疫调节和在病变部位直接参与骨代谢改建的过程实现MSCs的功能。

MSCs作为种子细胞与材料复合修复不同组织和器官的缺损、损伤是组织工程与再生医学研究的重要内容，研究和应用过程中材料与细胞的作用:相容性、定向诱导性、材料负载诱导因子与种子细胞复合修复大的缺点和病变将是研究重点。基于自体和异体干细胞的治疗也是突破的重点。