生长因子在组织生长、再生和稳定方面是必不可少的，它是有关细胞和分子水平行为的关键调节因子，人们深入对各类因子的认识和理解，为生物工程研究指出了新的方向。同时各种因子的应用也为生物材料植入、组织工程和再生医学做出开创性的贡献。本章总结了当前关于生长因子在两种组织(特别是血管组织和骨组织)中生物学或生理学的效应，还提供了一些研究概述，一是关于努力将有关生长因子的知识转化应用到生物材料方面，二是适当类型、浓度和适时序列的活性生长因子的递送，都会增强植入体(包括组织工程构造)的功能发挥。本章对未来在这些方面研究和发展的方向进行了概述。

组织和器官的生长和内稳态依赖于他们组成细胞和微环境的相互作用与功能，这是令人着迷又十分复杂的。到目前为止，这些细胞如何定向到特定位置，在特定组织和器官的特殊模式中又如何起作用仍不清楚，但这是集中探讨并且大有希望的研究。在发育学、分子学、细胞生物学、生物化学和医学方面取得的进展证实了各种各样的化学化合物(比如生长因子、细胞因子和趋化因子)都是由细胞产生的。这些因子在他们各自的微环境中以自分泌或旁分泌的形式表达活性，在细胞分子水平上提供必要的引导和调整关键的进程，这对组织的生长、修复和再生来说是必需的。这些贡献从健康和疾病两个角度解释了有关生物学和生理学方面的一些基本问题。相关领域的研究仍在进行，相信不远的将来会取得突破。

同时，生物工程研究者们积极探索将前面提到的基础研究中的有关发现转化到应用中，一些研究着眼于模仿自然进程，并且期望达到组织愈合、修复和再生。无论如何，人们已经意识到生长因子的必要性，人们认为生长因子是除细胞与材料之外组织构建和再生的必要组成部分，是组织工程的基本构成部分。毫无疑问，若想在组织工程中对生长因子进行有效利用，那就需要对其在不同组织生长和愈合过程中所充当的角色有一个整体的认识。因为在一篇文章中讨论所有哺乳动物组织和所有相关生长因子是不可能的，所以在本章节中，我们将集中阐述软硬组织的典型代表:脉管组织和骨组织。除了回顾当前有关生长因子在两种组织生长、愈合和修复过程中所扮演角色的认识，本章还列举了一些例子，是关于将这些知识应用于新一代生物材料的设计和组成，使可获得的生长因子加强植入体(包括组织工程构造)的长期表现。此外，这些领域的前沿研究在本章中突出显示出来，还有关于研究的未来方向和发展。

尽管生长因子在人体正常或者异常组织生成、治疗、再生中是不可缺少的一部分，以往的相关研究范围中，生长因子可以植入到生物材料和设备。在很长一段时间里，在这方面的研究主要解决其生物适应性，重点是生产的材料不能被排斥，或者能够让受者轻微耐受，在宿主的环境下保留生长因子的作用。随着新生物材料，尤其是组织工程和再生医学的出现，扩大了对新生组织的成功需求，并强调了对生长因子的直接作用和调控功能的要求。因此，大量研究致力于探究各种生长因子与生物材料结合，以此来促进体内或体外新生组织细胞相关功能，这些研究促进了一些生物材料的应用，但效果受限。即使如此，这些研究结果对于生理系统，特别是损伤修复与组织再生仍是必不可少的。

在体外研究，生长因子是不可少的，因为大量因子存在于细胞培养介质血清中。选择外来生长因子置于材料表面，生长因子固定或者包含在材料中，植入后从生物材料中释放出来。这些发展过程在模拟体内复杂组织愈合和再生过程中仍存有缺陷，因为一种生长因子作用和功能只是相关过程的一个方面。最近生物及生化因子的研究进展揭示了在特定的时间点及特定的浓度预先设定的顺序里表达的生长因子不止一种。例如，在损伤后，一种组织特定的生长因子分泌上调了，并出现在组织愈合的不同时间里。显然，每种生长因子的出现和其生物活性对于组织的成功愈合及再生是必要的。

目前的生物工程研究战略和方法是由生物学和生理学的进步激发的，将这种理论知识运用到设计和制造植入生物材料，这种方法将为植入材料和组织工程提供下一代的前沿的生物材料。毫无疑问，成功的结果需要坚持不懈的努力研究来实现不同生长因子在不同的剂量和持续时间里传递，至少能够模拟损伤愈合植入组织的生成的自然条件。

生理环境下，生长因子从细胞中分泌，在体液中仍保持可溶形式的细胞因子与膜结合或者与众多细胞外基质蛋白相连接。举例而言，VEGF-A的特定同种型(比如VEGF-A189)以及FGFs均可与细胞外基质蛋白相连，且其活性不变。对于这种现象的通常解释是生长因子阳离子结构域与带有阴离子的基质生物分子(如硫酸肝素蛋白聚糖)之间的相互作用。生物材料中生长因子转运机制的发展是基于对患者体内现象的观察。从这个方面看，不仅是生长因子的类型、浓度，其转运方式也参与决定其作用的发挥。在一些可能的策略中，团状递送模式可能不那么正确，因为在生长因子有效性持续的时间(因许多生长因子血浆半衰期较短)、组织形成的时间进程以及相关需求之间存在矛盾。替代策略的关注点则是建立方法，或者是固定具有生物活性的生物分子的方法，或者是使它们从种植的生物材料以及组织工程支架上以可用形式释放并在一定时间内得到理想生物结果的方法。各项用以固定和(或)释放这些生物活性化合物的技术已经被开发、改良，在生物医学应用中也被证明是成功的。

将生长因子(特别是每次运用的单因子)固定在材料基板上的方法用到了亲和位点的连接，这种连接包括简单的吸附作用以及共价结合。生长因子固定成功的一项重要检测标准是固定后生物分子活性的保持。通过限制可能影响到生物活性位点的构象变化，可以实现这个目标。比如，在基板表面通过同一构象和方位(标记到N)固定的鼠内皮细胞生长因子才具有活性，才能促进和增强细胞的增殖。所以，固定过程中生长因子活性的保留是各种方法开发及改良的关键。除了运用作为细胞外基质成分的生长因子的天然亲和力(例如VEGF的亲和力和肝素的FGF)，其他化学固定方法也被不断开发和改良。比如，将重组人源BMP( rhBMP-2)共价结合于羟基磷灰石( HA) (通过硅烷化或者强的钙螯合剂介导)可促进增强的AP分泌( C2C12小鼠成肌细胞体外成骨性分化指数) ;与HA表面吸收的等量rhBMP-2所得到的结果相比，将生长因子固定所获得的结果高出前者2. 5倍。在另一项研究中，与缺乏生长因子所获得的结果相比，以共价形式固定在胶原蛋白基质上的VEGF(用聚乙二醇-双丁二酸酯-羟基琥珀酰亚胺酯［SS-PEG-SS］连接)，显著地促进了HUVEC的增殖;在没有固定VEGF的胶原蛋白基质上只观察到了细胞增殖的增加，但并不显著。

总之，所有共价固定技术成功的最主要方面就是固定后的生长因子生物活性的保持。以这种模式递送生物因子的好处包括与溶解状态的生长因子相比，只需用很少量这种昂贵的化合物，却能够满足得到至少相同的生物活性的要求。也许，局部有效浓度更高是得到这种结果的原因。

单个有生物活性的化合物的释放是控制性给药领域中的研究热点以及能取得成功的方向。这个领域已经确立了药物释放的各项物理化学参数，比如载荷量(同种比异种，混合比包埋)、浓度以及释放动力学、释放时间、材料降解模式等。这项成果的取得被认为是从材料中释放的生长因子用于其他生物医学应用研究的起点和“蓝图”。这些应用首要考虑的问题是释放后生物分子活性的保持。VEGF、FGF、PDGF以及TGF的可溶形式都是有生物活性的。在一项研究骨相关生长因子的例子中，BMP、FGF、IGF、PDGF和TGF-β在溶解状态中仍有活性。许多研究表明释放的生长因子会在发育中的通信系统中发挥活性，以促进有关新组织的形成。在新血管网络形成过程中，VEGF被合成水凝胶类物质，包括藻酸盐、聚氨基葡糖藻酸盐和有肝素被覆层的聚氨基葡糖藻酸盐。在体外实验5天观察期内，从藻酸盐和聚氨基葡糖藻酸盐水凝胶释放出的VEGF扩散受到限制。藻酸盐水凝胶表面的肝素层会减缓VEGF的扩散，并会导致接近零级释放动力学。在另外一个体内实验中，FGF-1和FGF-2(与新血管形成有关的生长因子)被光交联成聚氨基葡糖水凝胶，并被植入小鼠背部皮下。在7～14天的时候，FGF-1和FGF-2均会从埋置剂中释放(聚氨基葡糖水凝胶被蛋白水解酶降解的结果)，这比没有生长因子或者单纯注射FGF，在生成更多新血管方面有显著的差异( P＜0. 001)。在另一项研究中，在小鸡绒膜尿囊隔膜和小鼠上的结果验证了VEGF生成血管的作用。VEGF-A共价固定的细胞浸润了纤维蛋白基质后，会诱导基质金属蛋白酶的活化，基质金属蛋白酶蛋白水解作用会释放生长因子。持续暴露在低剂量生成血管的生长因子下，会导致大批新血管形成，表现出正常的形态学和生理学特征。

另一些研究致力于改善新骨形成和研究多种释放系统，一些研究成果已经应用于临床。FDA批准可吸收明胶海绵可释放rhBMP-2用于一些整形外科治疗(比如复杂的脊柱愈合，开放的胫骨骨折)，口腔和颌面操作(牙槽嵴骨量增加)。与没有rhBMP-2的可吸收海绵治疗相比，BMP-2治疗会改善临界骨量的效果。这个系统确定的优势就是，在应用过程中可以通过调整支架摄取不同量的生长因子、缓冲系pH、胶原交联和选择rhBMP-2亚型的方式，来调整rhBMP-2的释放。为了提高临床有关生长因子递送系统，有关高分子复合材料陶瓷递送系统也在研究。聚乙烯乙二醇和rhBMP-2以51 : 49的比率配比溶解在丙酮中，然后充满了完全交联的多孔疏松的HA。丙酮的挥发导致均一相rhBMP-2高分子复合材料支架。植入大鼠桡骨缺陷8周后，缺陷被rhBMP-2修复了，并且显示全部愈合。相比而言，单纯植入支架材料或者未全充满的实验组显示不完全愈合。

总之，之前的研究已经确定了这种趋势，涉及血管网络修复和骨愈合，当前趋势就是运用生物学、生理学、生物化学和病理学中的先进知识，模拟标准型，弄清有关的浓度、搞懂有关现象的次序、骨愈合过程中生长因子的作用，同时回避引发特殊组织特征性表现的条件。利用这些生物分子的巨大潜能来调控细胞与植入材料相互作用，使新组织在植入材料周围形成变成可能。

在体内，许多生长因子在增强和抑制细胞和组织间的效应起到协同作用。这种认识促进了将至少两种生物医学相关应用的生长因子结合到新组织生成的研究。基于这种目的，生长因子可能以交替的方式或者以其他方式同时被释放。尽管这种潜在的生长因子活性的协同作用不容易理解，目前的研究提供了强有力证据，这种方式是一个重大进展。关于检测多种生长因子对哺乳动物组织生成的体内外研究报道呈逐渐增多之势。例如骨组织的相关应用，结合了IGF-1和PDGF-BB可以刺激牙周组织缺陷的骨修复。在一系列体内外研究中，IGF-1和TGF-β1的协同作用证明了骨诱导性。将IGF-1( 5%w/w)和TGF-β1 ( 1%w/w)混合到钛线的聚丙酯的薄膜上，然后释放出来，他们引起类成骨细胞的增殖，总蛋白增加，促进Ⅰ型原骨胶原合成。继续释放这两种生长因子，植入大鼠体内28天后，可造成骨折痂皮的重塑，并使矿化的组织增加。更重要的是，在这两种生长因子的作用下生成的骨组织表现为，能够承受更高的最大负重。通过植入两种生长因子BMP-2/OP-1和TGF-β1，灵长类动物的骨形成也会出现增效效果。局限性的IGF-I 和TGF-β的作用可加速骨折和截骨术的愈合。一个血管再生术的例子，以3:1的比例bFGF和VEGF植入改良的鼠类基质胶腔内可表现出协同作用。皮下注射小鼠和兔子含有两种血管源性生长因子，即PDGFBB和FGF-2，可形成血管网络结构，并且存留时间超过一年，甚至耗尽血管源性生长因子也存在。结果表明试验的两种生长因子在组建血管网络的过程均不可缺少，而不需要长时间的维持。此外，PDGF-B对VEGF-A和FGF-2协同促进新生血管的生成的信号作用仍需要探究。这给新组织的生成的各种生长因子的作用提供了新的研究方向。

提供两种生长因子第一次成功的策略之一是利用释放VEGF-165和PDGF-BB(结合于聚丙交酯-共-乙交酯)。血管内皮生长因子，出现在支架材料的表面，很快被释放(大约几天)。PDGF在掺入到聚合物支架后，结合到微粒子，释放速度缓慢(数周)。将双释放支架植入到大鼠皮下可形成无数、更大、更成熟血管。一项关于骨组织工程应用的研究结合了BMP-4和VEGF的传递作用。人类骨髓细胞可皮下植入小鼠体内15周。生骨和血管源生长因子的协同作用可以增强成骨细胞的功能，并可使新生骨的品质达到最好。这项研究扩大了之前的研究范畴，新的方法论可能为临床治疗应用和研究其他组织提供指导。

在成年哺乳动物胚胎发育、组织生长和创伤修复的过程中，血管系统的扩张是因为部分特定生长因子作用的结果。生长因子作用于内皮细胞及它们的前体，也作用于血管平滑肌细胞和间质支持细胞，在需要新血管形成和生长的时候，发挥关键性的引导作用。我们需要知道这些生长因子的生理学作用，比如它们生理学上的聚合物、生物活性、释放时机和在疾病与健康两方面的协同都是如何发挥作用的，目的就是为了将生长因子应用于治疗上，在生物植入体和组织工程构建过程中，新的血管能够在组织和器官里生长。

周围血管的形成和发展包括两个进程:血管发生(是指胚胎期血管从成血管细胞发展而来从无到有的过程) ;血管生成(是指出生后从原有血管主要是毛细血管和毛细血管后静脉以芽生的方式长出新的血管)。胚胎学上的血管发展包括血管发生和血管生成两个方面，但是出生后组织的生长和损伤修复主要包括血管生成。就人类而言，血管发生是从发育第三周开始的。血管发生的第一步是成血管细胞聚集，分化成内皮样细胞，在胚胎外的中胚层形成血岛。老鼠模型已经证实内皮样细胞(形成血岛)的增殖和变扁平导致管腔的形成。在胚胎发育的过程中，原始血管网络的成熟需要靠内皮细胞的进一步分化。原始的动静脉是以上述方式形成的，而毛细血管则是通过血管生成方式形成。

毛细血管网络是通过血管生成而形成的，其在组织与器官之间渗透并建立起了物质运输通道，运输氧、营养成分和代谢废物。在损伤愈合的过程中，毛细血管网络的重建或改建也是通过血管生成实现的。血管发生具有血管内皮尖端细胞的特征，血管内皮尖端细胞来源于已形成的血管并且引导毛细血管的生长。只有当与其他血管发生结合的时候，尖端细胞才会移行，但是不会增殖。接着尖端细胞一分为二形成支持柄细胞，柄细胞会随着血管的延伸而增殖。网结现象发生后，通过索状结构凹陷和细胞内空泡形成融合等方式，血管会形成管腔。血管的成熟则需要壁细胞募集和引导冗余细胞凋亡。

不同细胞群(特别是内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、周细胞)的不同组合参与血管的形成和不同类型血管(毛细血管、动脉、静脉)的塑造。因此，不同血管的胞外基质有差别。在有关生理刺激下(包括生理化学和生物力学刺激)，血管网络会发生改建。

VEGF，是研究最为广泛的关于内皮细胞迁移、增殖和分化的激动剂，在血管组织发展和维持稳定的每一阶段都充当重要角色。VEGF家族是血小板源性生长因子族( PDGF)的一个亚族，包括VEGF-A、VEGFB、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子。VEGF-A是血管发生和血管生成的主要调节者。VEGF-A在人体内有3种主要的亚型: 121-、165-和189-氨基酸型。VEGF-A165，作为最常见的亚型，负责调节VEGF的大部分生理效应。VEGF-A121是最短的亚型，由其所在位点释放，弥散入血清，但是不与附近的胞外基质蛋白结合。VEGF-A165对Ⅰ型跨膜糖蛋白和肝素的亲和力较差，但VEGF-A189与肝素有较强的亲和性，并且在其释放时会与ECM结合。VEGF-A165与ECM的结合导致VEGF在组织中生长因子释放位点周围会有不同浓度梯度。

VEGF对细胞的影响是通过它与细胞膜表面受体相互作用而实现的。在血管生成过程中，内皮细胞上有两个重要的VEGF-A受体: VEGFR-1( Flt-1)和VEGFR-2( Flk-1)。与VEGFR2相比，VEGFR1与VEGF-A有更好的亲和力。但是，VEGFR-2酪氨酸激酶的活性是VEGFR-1的十倍。发育过程中血岛的形成是受VEGF-A和VEGFR-2调控的。这两种蛋白任一敲除小鼠(甚至杂合变异)都显示出，早期胚胎发育时缺少血岛形成和血管发生。这个结果表明，正常血管形成需要一个最低VEGF的水平。尽管VEGFR-1敲除小鼠仍具有血管发生的表现，但新形成的血管紊乱并且功能失调。那我们就可以假设，VEGFR-1与VEGF-A的高亲和力是调整VEGF-A浓度的机制，目的是抑制VEGFR-2的过刺激。一旦血岛形成，VEGFA就会促进新形成的内皮细胞向血岛周围迁移并且增殖，从而导致原始血管的进一步扩展和相互吻合。

关于小鼠视网膜(血管生成模型)的研究表明，细胞外VEGF-A的浓度梯度引导了内皮尖端细胞的扩充和迁移。尖端细胞丝状伪足上高表达的VEGFR-2，引导内皮细胞向VEGF-A浓度最高的方向迁移。内皮柄细胞的增殖也是由VEGF-A通过VEGFR-2受体调控的;不管怎样，在这个实验中，细胞增殖取决于VEGF-A的局部浓度，而不是VEGF-A的浓度梯度。在体外实验，VEGF-A165以剂量依赖的形式引导牛微血管细胞在胶原凝胶类基质中形成毛细血管样结构。在这个实验中，100ng/ml注入量的VEGF-A165会诱导最大量的这种血管结构。

在成年人体中，大部分血管化组织中都会表达低剂量水平的VEGF-A，它在维持正常血管系统中发挥了重要作用。同时，成年组织中高水平的VEGF-A会导致血管产生漏洞、出血。在培养原代人类脐静脉内皮细胞( human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的过程中，VEGF-A使其免受血清饥饿而凋亡。在人的许多不同细胞(比如肌细胞)中，缺氧会诱导VEGF-A的产生，使其在周围组织和血清中的浓度都有所增高。这种VEGF-A正调节机制包括增长的低氧诱导因子-1α( hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)。不管在健康还是疾病状态下的缺氧组织中，VEGF-A在新血管形成过程中都是十分重要的。在最近的案例中，它是肿瘤抑制治疗研究的一个靶点。

VEGF会增加毛细血管的通透性，这是炎症反应的一个重要特征。潜在的机制包括氮的氧化物合酶诱导，导致NO产生增多和血管组织内皮下层的血管平滑肌细胞松解。血管通透性增加的一个结果就是血管壁组织中血浆蛋白(比如纤维蛋白原)的沉积，特别是纤维蛋白原接着会促进生成血管的芽殖。VEGF也会诱导胞外基质金属蛋白酶的表达，特定的MMPs会降解基底细胞膜，从而促进血管生成中的芽殖。VEGF在内皮细胞前体或者基质前体细胞的募集、活化、分化过程中发挥着重要作用。VEGF受体存在于定向造血干细胞中，此外，骨髓血清中的VEGF对HSC有趋化现象。VEGF招募的HSC参与血管生成。总之，VEGF参与原始血管组织的构建，引导毛细血管的生长，影响内皮细胞的增殖，内皮细胞前体的募集和定型，创伤修复，正常血管组织的稳定。因为VEGF对血管组织形成、修复、发展的方方面面都产生影响，所以对血管组织形成和其他组织器官血管化或组织工程构建来说，它几乎是生长因子家族中最重要的候选者。如果单单用VEGF，即使用很高的剂量，也不太可能导致有功能的血管组织形成，VEGF必须与其他一些重要的因子联合使用。

许多细胞(特别是巨噬细胞和肿瘤细胞)都分泌FGFs。大约有20种FGFs，但是与血管系统密切相关的只有酸性FGF( aFGF或FGF-1)和碱性FGF( bFGF或FGF-2)。这些生长因子通过激活靶细胞细胞膜上的酪氨酸激酶受体FGFR1和FGFR2来发挥活性。bFGF直接影响胚胎发育期中胚层的团聚。在体外，1ng/ml～50ng/ml bFGF的生理学浓聚物以一种剂量依赖性的方式诱导内皮细胞增殖。此外，bFGF促进血岛中新形成内皮细胞的迁移和增殖，并且导致原始血管网络伴随着腔洞扩大、融合而形成。bFGF对于新发育血管系统的维持来说很重要。FGF通过直接和间接的途径来影响血管生成，这些途径包括对其他一些重要生成血管因子(比如VEGF)特异受体的正调节。bFGF促进内皮细胞和间质细胞中VEGF的表达。bFGF会与VEGF协同作用，促进内皮细胞迁移和增殖。

PDGFs与VEGF同属一个超家族，是平滑肌细胞和周细胞增殖、迁移、募集的有效调节因子。有五种PDGFs: PDGF-A，PDGF-AB，PDGF-C，PDGF-BB和PDGF-D。PDGFs通过细胞膜上的PDGFR-α和PDGFR-β两种受体来发挥作用。体内有关血管系统中最为普遍的PDGFs和PDGFRs作用系统是PDGF-BB和PDGFR-β的相互作用。PDGF对平滑肌细胞和周细胞的调节对血管系统形成来说是至关重要的，因为这些细胞类型会形成发育成熟血管支持性的壁层，但是毛细血管在壁层中缺少一层血管平滑肌细胞。形成毛细血管的尖端细胞表达的PDGF-BB被认为通过作用于PDGF-β来募集平滑肌细胞和周细胞前体。腔壁细胞的支持对新血管的稳定起到了至关重要的作用。除了对细胞功能的直接影响，PDGFs还与其他生长因子相互作用。在血管生成的过程中，bFGF单独只引起平滑肌细胞和周细胞中等水平的募集反应和增殖，但是当与PDGF-BB联合时，其作用就会增强。此外，人们认为PDGF-BB和bFGF联合作用于平滑肌细胞上，会导致血管间质的成熟和稳定。这两种生长因子的协同是由于受体的连接。bFGF会导致平滑肌细胞和周细胞PDGFR上的PGFR-1反式激活，从而诱导细胞的成熟。

TGF-β是早期血管发育和血管生成过程中一个重要的调节因子。TGF-β超家族有差不多30种蛋白质包括骨形态发生蛋白( BMPs)。细胞上有两种类型TGF-β受体，两种都是丝氨酸-苏氨酸激酶。Ⅱ型受体(比如TGFβRⅡ)与生长因子结合后磷酸化Ⅰ型受体(比如激活素受体样激酶1［ALK 1］)，Ⅰ型受体进而活化细胞内信号转导通路。对于TGF-β家族所有生长因子和受体来说，TGF-β1与TGF bRⅡ、ALK1的相互作用与血管组织的相关性最大。

TGF-β1被包括内皮细胞和其他血管组织细胞(比如周细胞)在内的不同类型细胞表达，并且通过这些细胞促进胞外基质的合成和沉积。TGF-β1诱导平滑肌细胞的分化和从周围间质细胞中的募集。内皮细胞和平滑肌细胞中TGF-β1的影响是剂量依赖性的。低剂量( 0. 2ng/ml～0. 5ng/ml)的TGF-β1正调节血管生成蛋白和蛋白类物质，进而促进血管的更新和生长。高剂量的TGF-β抑制内皮细胞的增殖，并且通过内皮细胞和平滑肌细胞来促进胞外基质的沉积，这会促进血管壁组织的成熟和稳定。TGF-β或其受体( TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ)的突变会导致血管系统的紊乱和小鼠胚胎中形成的血管比较脆弱。

相比前面提到的体内影响，TGF-β在体外的影响有所不同:在10pg/ml到10ng/ml范围内，TGF-β会抑制培养的内皮细胞增殖。TGF-β体内和体外影响的差别提示我们: TGF-β在体内的双向性作用可能是由于TGF-β与其他生长因子或者生长因子受体作用的结果。比如，既然TGF-β像在人内皮细胞中正调节VEGF信使RNA的表达那样，在小鼠成纤维细胞中也发挥同样的作用，那么VEGF的表达(由于TGF-β)在体内就可能促使内皮细胞增殖。生长因子(特别是TGF-β和VEGF)的存在与否以及富集，会导致细胞的凋亡，这过程是血管网络重塑进程的组成部分。

血管深入到损伤组织中是愈合过程所必需的，此过程是通过血管生成的机制来实现的。损伤部位内部或者周围的未损伤组织会产生浸润血管芽，这与生长因子的复杂表达密切相关。牵扯到愈合应答的许多细胞类型(包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、血小板、巨噬细胞和中心粒细胞在内)都会表达VEGF。VEGF引起血管舒张，基底细胞膜蛋白的降解，内皮细胞迁移和增殖。损伤发生后不久，在愈合过程中的炎性反应阶段，局部VEGF水平增高是由有活性的血小板和炎症性细胞释放VEGF引起的。损伤组织内或者周围血管组织中的内皮细胞和平滑肌细胞分泌的VEGF，在损伤之后的一天内呈现出正性调节，并且损伤后的早期3天促使毛细血管长入损伤部位。VEGF释放和扩散会形成一个浓度梯度，从而引导向缺氧组织的血管生成。VEGF在炎性反应阶段之后也是十分关键的，在2到7天的增殖阶段VEGF的表达达到巅峰。BFGF在血管组织损伤愈合中也是十分重要的。BFGF水平在血管损伤后立即会出现一个峰值，直到3天左右的增殖阶段才稳定下来。bFGF在经过一个低表达水平阶段后，8天左右血管生成基本完成后，bFGF的水平会增高到最高值。可以由此猜测，损伤后组织中bFGF的释放是最初bFGF出现峰值的原因，这对VEGF的正调节负责。第二个bFGF峰值是因为新形成毛细血管内皮细胞的合成和释放。bFG从而调节管腔形成和基底细胞膜发育。

血管的形成和退化在多种病理状态下扮演了一个重要的角色。病理状态下血管的异常功能与不同生长因子的表达有关。在许多恶性肿瘤、年龄相关性的黄斑变性、增生性视网膜病变、风湿性关节炎、脑水肿、动脉粥样硬化、肺动(静)脉高压等一些疾病或者综合征中，生长因子会影响血管网络，被公认为产生了关键性的影响。血管生长因子在病理状态下所扮演角色的一个显著的例子就是在恶性肿瘤中的表现。大部分实体瘤细胞分泌超出正常范围的高水平VEGF，通过这种机制肿瘤促进血管网络形成，来满足其生存生长的需要。此外，肿瘤的支持性间质细胞也分泌不正常的高水平VEGF。将VEGF中和剂和VEGFR拮抗剂应用于临床，会阻碍血管网络的形成与稳定，并且阻止了肿瘤在一些癌症中的生长，说明VEGF在肿瘤生长中发挥重要作用。bFGF和TGF-β也在一些啮齿类和人类肿瘤中发挥了作用。TGF-β在一些肿瘤中大量分泌，稳定新形成的血管，并且抑制免疫反应。在血管生成的过程中，bFGF尤其会促进内皮细胞增殖、迁移和黏附，所有形成新血管的关键性步骤，我们都可利用bFGF和它的受体作为抗癌治疗的靶点。事实上，使用抗bFGF抗体会通过抑制血管生成来阻碍一些癌症的生长或者使其停止生长。

生长因子与其细胞膜上受体之间复杂的相互作用调控着新骨形成和骨生长、修复过程。生长因子参与骨祖细胞的募集、成骨细胞分化、前成骨细胞增殖、其他一些成骨细胞功能(与新组织形成有关)以及骨组织有机和无机成分的形成。因为生长因子在骨形成和修复中的机制十分复杂，所以我们必须了解整个过程，目的是将恰当的生长因子成功应用于整形外科和牙科领域的治疗上。在这方面，生长因子起作用取决于生理和病理状态下的可用性、定位、聚集、生物活度、细胞膜上各自受体的表达与活化、作用时机以及不同生长因子之间的相互作用。

骨形成有两种方式:软骨成骨和膜内成骨。软骨成骨是长骨形成的方式，比如股骨。膜内成骨是扁骨形成的方式，比如颅骨。长骨的软骨成骨开始于上皮细胞和间质细胞的相互作用，导致枝芽形成。这时，目前为止还没有弄清楚的信号会促使芽中的间质岛形成。岛中心的细胞会分化成软骨样细胞，它们周围会围着一层未分化细胞，随后未分化细胞会分化成软骨膜和骨膜。生长因子会调控血管生成，血管生成在骨形成过程中十分重要。新血管的形成是软骨样组织转变成骨的标志。VEGF浓度梯度诱导新血管长入到软骨组织中，因此促进骨的生长。伴随着血管的侵入，软骨骨化，同时骨髓腔形成。一些研究表明，在骨骼发育期阻断血管生成，那么骨形成就不会发生。骨骼发育期的血管生成会促进软骨的衰弱，接下来才会发生新形成组织的骨化过程。包括破骨细胞在内的骨祖细胞，与新形成的毛细血管一起，在骨形成和降解钙化软骨的过程中起作用，这会引发血管侵入和生长位置上的新骨形成。VEGF通过内皮细胞与骨祖细胞之间直接的细胞交流来调节成骨细胞的分化，这些细胞存在于形成期骨骼中新形成毛细血管的血液里。总之，血管生成是新骨形成过程中的关键部分。

膜内骨形成是扁骨的特征性表现，比如颅骨的形成，没有软骨化阶段。最初，间质干细胞在骨形成的区域聚集，形成间质岛，接着分化成骨祖细胞，骨祖细胞分泌Ⅰ型胶原并分化成成骨细胞。岛周围的血管长入到新形成骨组织中，并促进后来的血管为骨提供支持。随着成骨细胞的迁移和增殖，它们分泌ECM成分并形成骨小梁结构，融合在一起后形成海绵状骨或网状骨。随着骨梁结构的合并，外围骨层改建，最终皮质骨层形成，包绕网状骨核心。

骨形态发生蛋白作为TGF超家族的一员，包括超过20种亚型。BMPs是骨形成过程的强激动剂，促使间质细胞分化成骨细胞。BMPs最初由成骨细胞分泌。细胞膜上有两种BMP受体，两者都属于丝氨酸-苏氨酸激酶类。BMP与Ⅱ型受体的结合会导致其受体与Ⅰ型受体的二聚作用，并且会使Ⅰ型受体磷酸化，进而活化下游信号肽。在促进多向性间质细胞分化成成骨细胞的过程中，BMP家族中的BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和BMP-9发挥了重要作用，它们还会促使骨量增加。不管在体内还是体外，BMPs都会促进巨噬细胞-粒细胞谱系里单核造血细胞的融合，这会导致破骨细胞的形成和活化，进而在骨修复和发育的最后阶段促进骨的更新重塑。关于这个过程的一些细节还没有弄清楚，并且一些现象都是互相矛盾的。不同骨细胞中BMPs，呈现出二相性的剂量依赖性的现象，就像最近体外研究中的BMP-5和BMP-6，或许会解决这种争论。特别是BMP-5和BMP-6剂量超过300ng/ml时，会抑制破骨细胞的形成和功能;但是在低剂量( 0. 1～10ng/ml)时，会激活破骨细胞的生成。

在体外，FGF-1和FGF-2可引起祖细胞及成骨细胞的增殖，诱导碱性磷酸酶的活性，以及Ⅰ型胶原蛋白的产生。FGF-2致有丝分裂的作用是FGF-1的约十倍，FGF-2以一种剂量依赖的方式抑制鼠类骨祖细胞向成骨细胞的分化。

有两种IGF，分别是IGF-1和IGF-2，在骨组织生长中起到重要作用。IGF-2在骨组织中含量较高，而IGF-1则作用更有效。IGF-2，尤其IFG-1可引起增殖的成骨细胞再增殖，并可增强其他成骨细胞的功能，比如其趋化作用。当IGF由成骨细胞分泌，它可以以旁分泌和自分泌的方式发挥作用。这种生物效应受胰岛素样生长因子结合蛋白( IGFBPs)的调节，IGFBPs可结合额量的IGF，因此可以抑制相关细胞受体的活性。除了起主要的抑制性调节作用，某些IGFBPs可以刺激和加强IGF的信号作用，IGF在促进骨组织愈合与其他多种生长因子(例如TGF-b，PDGF-BB，BMP-2)协同作用。

虽然成骨细胞只表达血小板源生长因子A( PDGF-A)的亚型，PDGF-BB对成骨细胞的生物活性是最显著的，它对促进成骨细胞的增殖作用微乎其微，但可促进间叶细胞的增殖。成骨细胞和骨祖细胞在PDGF的作用下迁移。

有5种TGF-β亚型，所有的TGF-β超家族(包括BMPs(骨形态发生蛋白)，TFG-βs)在细胞增殖、分化、细胞外基质蛋白的合成以及细胞凋亡起着重要调节作用。TFG-β，在体内广泛存在，而在骨及软骨组织中的含量较高。它由成骨细胞分泌，储存在骨细胞外基质。在体外，TGF-β可以促进骨祖细胞的增殖，而随后骨祖细胞分化为成骨细胞。在骨组织塑形修复后期阶段，TGF-β也可以抑制骨祖细胞向成骨细胞分化。TGF对成骨细胞和骨祖细胞这种相反的作用取决于其浓度。TGF-β1高浓度( 10ng/ml的剂量，或者1ng/ml的剂量，一周给予4次)引起成骨细胞功能的下降，而低浓度(每周1ng/ml)却能增强成骨细胞的功能，促进新骨组织的形成。TGF-β1在肢体发育中，刺激细胞的迁移和聚集也起到重要作用。通过减少细胞的凋亡，TGF-β1对骨细胞起到保护作用。此外，TGF-β1可以促进成骨细胞的糖胺聚糖的合成，比如硫酸软骨素，在新生的大鼠颅骨和MC3T3-E1细胞的培养时的核心蛋白多糖。

生长因子在骨组织的损伤愈合过程中起到重要作用，例如BMPs(骨形态发生蛋白)，在治疗骨折的过程中起到合成和决定次序的作用，并加速骨组织修复过程的不同阶段。模型1的小鼠在骨折后的第一天，BMP-2的表达达到最高水平，BMP-2也可诱导成一些肌细胞向成骨细胞系的分化。此外，BMP-2在骨组织的新生和修复早期过程中，骨祖细胞分化为成骨细胞发挥着最重要的作用。在软骨吸收和成骨细胞集聚期间(小鼠模型中，14～21天每周期) BMP-3、BMP-7及BMP-8高浓度表达。然而，有研究报道BMP-7表达的增加出现在大鼠骨折修复早期阶段。BMP-5和BMP-6在骨组织修复全过程均表达，但并不在骨组织损伤后立即表达。在体内骨组织修复过程中，FGFs由多种类型细胞合成，包括巨噬细胞、间叶细胞、成骨细胞及软骨细胞。在小鼠模型中，FGFs已确定在骨折愈合早期阶段表达。IGFs已发现在人体肉芽组织和骨痂中表达; IGF-2 mRNA可由内皮细胞和间叶细胞表达，同时IGF-1和IGF-2均可由成骨细胞和软骨细胞表达。在骨折后的止血过程中，血小板活化，释放PDGFs。PDGFs也可由巨噬细胞、内皮细胞及成骨细胞合成，通过旁分泌和自分泌机制发挥作用。在骨折最早期修复过程中，PDGF发现由近骨膜的巨噬细胞分泌。在人体骨折活检组织中，PDGF由肉芽组织的内皮细胞和间叶细胞分泌，随后发现由成骨细胞、软骨细胞及破骨细胞分泌。在骨折愈合中，TGF-β最初的增加认为是由在血肿形成期的血小板释放的。在小鼠软骨内的骨组织形成期间，这种生长因子随后由软骨细胞和成骨细胞产生。TGF-β2和TGF-β3在小鼠骨折后7天分泌量达最高，这同软骨形成高峰是一致的。TGF-β1的分泌贯穿整个骨折修复阶段，其高峰分泌只出现在大鼠的骨损伤初期。

生长因子及生长因子受体的异常表达与不同的骨组织的病理状态密切相关，包括骨质疏松症、骨骼畸形、骨恶变以及骨赘(骨刺)的形成。例如，进行性骨干发育异常，这是常染色体显性基因疾病，随着长骨、颅骨及骨盆的骨干骨皮质增厚，引起肌肉营养不良的类似症状，其发生随TGF-β1基因的变异出现。另一个说明骨组织的生长因子的重要性的例子，即FGFRs基因的突变可引起骨组织新生过程中出现异常骨组织，导致人体软骨发育不良。骨质疏松症与多种生长因子的异常有关，BMP、FGF及IGFs与其发病机制有关。BMPs促进和调节骨祖细胞的分化及成骨细胞的增殖，而在骨质疏松症，抑制了这两项功能。BMP在小鼠模型中的缺乏证实了类骨质疏松症的条件，源于成骨细胞的减少和骨祖细胞的分化的减少。IGF-1水平的下降，因异常的骨祖细胞的分化，易导致小鼠患骨质疏松症。女性的IGF-I与骨矿物质密度有密切关系。FGF在骨质疏松症也有重要作用，被切除卵巢的大鼠用FGF治疗证实了骨组织损失的降低源于成骨细胞的产生增加以及细胞外基质的成分分泌，生长因子在许多疾病的发病机制发挥作用，这些具体例子充分表现了生长因子在健康和疾病中起到重要作用。

所有的组织和器官(除了软骨)，均含有血管，并且依赖血管存活和维持功能及其完整和稳态。在体内，由于扩散的范围有限，大部分细胞距离最近的毛细血管超过几百微米就不能存活。因此，血管性组织的生成、生长、再生、愈合均需要有血管网络的营养。

根据以上的认识和理解，我们可以在体内外积极探索血管源性生物工程组织和器官的发展。随着生物学、细胞生物学、分子生物学、生物医学工程等的进步，这些研究领域也会受益。为了实现富含血管的骨组织的再生，我们利用了一些基质、细胞和能够促进血管和骨组织形成的生长因子。比如利用促血管生成的bFGF和有骨诱导性的BMP-2可以促进大鼠的骨组织形成。相关实验结果表明，bFGF的存在可以引诱毛细血管更快侵入到移植物上。另一项研究，相关质粒DNA摄入和结合之后，BMP-4由人类骨髓基质细胞表达，VEGF则通过传统的吸附到PLGA基质被结合到新生长的骨组织。随着VEGF可引起血管网络结构的形成，人类骨髓基质细胞表达BMP-4增强，则有助于新骨组织的生成。这样随着血管源性和骨诱导性生长因子的出现，新生成的骨组织将会越多。

VEGF和BMP-2从结合到聚丙烯基质的凝胶微球体释放出来，利用缺陷的大鼠颅骨实验，可以产生时间依赖性的效应，同采用空白和单因子的实验结果比较，双因子的作用显著刺激了骨组织生长。上述的研究表明了多种生长因子对新组织生长的重要性，这对随后的相关研究和组织工程的应用是很重要的。

尽管生长因子的同时释放在技术层面来看比其序贯性的作用要简单，但是后者并非是模仿复杂的、大量的、时间依赖性生物分子的表达。不同于研究多种生长因子的结合作用，连续作用的生长因子的研究没有得到应有的关注。

实验研究将BMP-2和IGF-1有组织地放到两层明胶上，观察生物材料递送的生长因子短暂变化对骨细胞反应的效应。明胶层不放或者只放BMP-2、IGF-1其中的一种或者放BMP-2和IGF-1。每一凝胶层包含1. 25～2. 5μg的BMP-2和(或) 50～100ng的IGF-1。生长因子以二相性的形式释放，第一天时凝胶最顶层的生长因子大量释放(最大250ng)，到第六天的时候减少到几乎为零。同时，最底层的生长因子在第四天开始释放，第六天达到一个峰值( 175ng)，第十天检测不到浓度。这些材料设计好了两种生长因子的释放程序。在体外监测大鼠多能细胞( C3H10T1/2［C3H］)和大鼠骨髓细胞的成骨反应。结果显示C3H细胞的AP活性因为释放的次序而产生了差异。BMP-2而不是IGF-1刺激成骨细胞的分化和增殖。重要的是，细胞实验验证IGF-1减弱了BMP-2的效应。第一天BMP-2的治疗和第四天开始的IGF-1、BMP-2释放诱导了DNA容量的显著增多和AP活性的增高。在这个研究中，BMP的存在可能会正调节CH3细胞表面IGF受体的表达。当这两种生长因子的传递机制在BMCs上试验时，先释放IGF-1接着释放BMP-2的治疗会诱导间质细胞增殖加速和活性增强。不管是BMP-2复合IGF-1还是IGF-1复合BMP-2的治疗都会诱导细胞增殖和功能表达增强。这些结果无疑证明生长因子递送的次序会诱导有关新组织形成细胞的功能。最重要的是，此研究表明生物材料模拟生理状态下生长因子递送程序的策略是十分可行的。

通过采用生长因子来刺激身体自然愈合过程，在生物材料的应用下，这对增强组织再生是很有效果的。这些有活力的分子通过生物材料可以传递到组织和细胞的接触面，这些分子可以来自自身的，化学合成的，或者源自培养基释放出来。

毫无疑问，这些努力反映了生物工程领域的新研究方向，为植入材料、组织工程和再生医学提供了潜在的价值。对所研究活动的内在机制和正常与疾病体内生长因子长期作用的认识和阐明，展示了十分有价值的见解，有利于生物材料学家和生物医学工程师的研究。这项领域在目前和未来面临的主要挑战是:把最新和未来在这项相关科学领域的成果与发现解释并结合到相关的生物医学领域。因此，未来的成功需要创新性的、独特的方法转移和结合相关的知识，如生理知识、新一代生物材料和制作技术。

虽然迄今所取得的成就已经建立了参数的重要性，如类型、浓度、释放动力学和与新组织形成有关细胞功能的生长因子的生物活性，还需要进一步的研究来阐明基本机制。提供一个以上的生物分子序列的重要性越来越多地被承认，作为新组织形成一种改进的和非常有前途的过程的模型。这个令人兴奋的领域需要深入的研究和广泛的发展。除了选择生物分子的组合，他们的相互作用和(或)依赖于其他能够影响释放的或固化的生长因子的生物活性组件(如细胞外蛋白相关的微环境和细胞因子)必须检验。

未来发展的挑战包括选择适当的生物分子和生物活性剂传递到细胞的适宜模式。为了避免源自生长因子的多向性的并发症，在内源性和重组制剂必须做出合理选择。除了用于释放和固定的模式，到目前为止，生长因子可利用的其他模式还需探究。复杂的、时间依赖性的相互作用的生物分子还未探索，需要更多的研究来阐明关键的方面，即局部的(微环境)和生物分子的连续性释放的系统作用的影响。除了研究一个特定的谱系分化的细胞，生长因子对祖细胞和多能干细胞的影响还必须确定。从材料的角度来看，控制固定生物分子的取向/演示方法的发展，这对于配体受体结合领域被发现，和(或)激活细胞的相互作用将是有益的。

毫无疑问，这是在生物材料中的生长因子应用的开始，然而因为高端和仍然尚未开发的潜力，这将拥有无限的未来。在本章中概括的和讨论的方法将提供新的和重要的基础科学的信息，将用于设计新一代生物材料，可以提供生长因子并促进新组织形成有关的各种生物工程的应用。血管网络系统及骨组织的发展和稳态取决于细胞间的复杂相互作用及细胞与细胞外基质(包括基质、化学、生物、物理的因素的刺激)的作用，以往的研究证实了关键成分，并解释了基本的生理过程的重要方面，比如组织器官的发展、功能、治疗与修复。一些机制细节和相关的知识还不清楚，或者只有部分能解释。正在进行的研究，尤其是对组织形成的分子机制的研究，对于像再生医学这样的前沿领域有很大帮助。