第三节　肾癌干细胞与外泌体

一、肾癌组织中存在肿瘤干细胞

2008年，Bussolati等在人肾细胞癌中鉴定出表达间充质干细胞标志物CD105的肿瘤起始细胞（tumor-initiating cells），它显示干细胞特征，如克隆形成能力，表达Nestin、Nanog与Oct3-4等干细胞标志；并缺少分化标志物。CD105⁺细胞有分化上皮和内皮细胞的能力以及在动物体内成为移植性肿瘤。

二、肾癌干细胞来源的外泌体

肿瘤来源的外泌体/小囊泡作为肿瘤和基质细胞（stromal cells）之间遗传信息交换的媒介体（vehicle），产生癌发展的有利微环境。在肿瘤组织内，所有细胞类型都可能有助于外泌体/小囊泡的排出，但是，有助于肿瘤进展的特有机制尚待阐明。肿瘤细胞产生大量外泌体/小囊泡，它们可进入血液循环和其他体液，由于外泌体/小囊泡具有多向性作用，它们可能与癌的发生、发展和转移前微环境形成有关。正如前面提及的外泌体/小囊泡含有mRNAs、microRNA和蛋白质可能被转递到靶细胞引起表观遗传的变化，并可成为新的诊断标志物。

三、肾癌干细胞来源的外泌体/小囊泡

研究显示正常干细胞是外泌体/小囊泡的丰富来源。对肾癌中CD105⁺肿瘤干细胞释放的小囊泡（MVs）是否可能引起血管生成作用，而修改肿瘤微环境以及有利前转移微环境（premetastatic niche）的形成，Grange 等进行了研究。CD105⁺肾癌干细胞与CD105^-肾癌干细胞来源的小囊泡进行比较，电子显微镜观察，其形态相似，大小相同（10～100nm）图9-6。

图9-6　电子显微镜观察小囊泡的特征

A与B 形态相似，大小相同，但CD105 ⁺与CD105 ^-在小囊泡内表达不一样

CD105⁺肾癌干细胞与CD105^-肾癌干细胞来源的小囊泡之间的主要差异是CD105的表达，CD105表达仅存在于CD105⁺细胞来源的小囊泡，而不是来源CD105^-细胞的小囊泡。CD105⁺与CD105^-的小囊泡均表达CD44和粘连分子，如a5^- 和a6^-整合素（integrins）；而CD29仅在CD105⁺微囊泡中可测到，在CD105^-小囊泡中为阴性；CD105⁺与CD105^-小囊泡均不表达HLA1和CD73。

四、CD105⁺小囊泡体外激活人脐带静脉内皮细胞（HUVEC）

肾癌干细胞来源的CD105⁺小囊泡是否能刺激肿瘤血管生成和浸润，Grange 等以CD105^-肿瘤细胞来源的小囊泡比较它们的作用。首先观察用PKH26染料标记的CD105⁺和 CD105^-小囊泡被HUVEC摄取情况。CD105⁺和 CD105^-小囊泡与HUVEC共孵育1小时，CD105⁺和 CD105^-小囊泡掺入HUVEC的情况是相同的。来自肿瘤干细胞的CD105⁺小囊泡和起源被刺激的HUVEC在体外（in vitro）Matrigel上毛细血管样结构形成。结果显示：肿瘤干细胞来源的CD105⁺小囊泡在体外有刺激毛细血管样结构形成，相反，肿瘤细胞来源的CD105^-小囊泡没有诱导毛细血管样结构形成；没有分选的肿瘤细胞来源的小囊泡也能诱导毛细血管样结构形成，但是，分选的CD105⁺小囊泡的前细血管生成作用（proangiogenetic effect）明显比较大，其浸润也增强。CD10⁵⁺小囊泡明显增强HUVECs的侵袭性（invasion），但CD105^-小囊泡不能。CD105⁺小囊泡也能诱导以多柔比星（doxorubicin处理的HUVECs，使其有较强的凋亡抗性。CD105⁺囊泡用RNA酶前处理，在体外明显降低毛细血管样结构形成和增强的浸润，凋亡的抵抗以及粘连特征，显示小囊泡携带有RNA分子的作用。

五、肾癌干细胞分泌的CD105⁺小囊泡在体内的作用

为了评估肾癌干细胞分泌的CD105⁺小囊泡是否能在体内刺激血管生成作用，Grange等将小囊泡刺激的HUVECs 的Matrigel侵袭克隆，注射到SCID小鼠皮下。结果显示：从克隆肿瘤干细胞来的CD105⁺小囊泡刺激HUVECs生长，形成密集的细胞群含有小脉管与鼠血管相连，并成动脉瘤样结构（图9-7）。生长在Matrigel内的细胞与小脉管表达内皮标志物vWF，HLA 1染色阳性，证明为人特征。生长在Matrigel内的细胞与小脉管表达内皮标志物vWF，HLA 1染色阳性，证明为人特征。

图9-7　CD105 ⁺小囊泡刺激的HUVECs在体外的血管形成作用

给SCID小鼠静脉注射70mg小囊泡5天，接着再静脉注射6×10⁵肾癌细胞，5周后，处死动物，取动物的肝、脾、肾和肺。记录转移病例数，明显转移病灶仅发现在肺脏（图9-8）。小鼠只注射媒介物、CD105小囊泡或RNase，CD105⁺小囊泡诱发的转移数是很低的。小鼠用CD105⁺小囊泡或未分选的肿瘤细胞作前处理，观察到转移病灶数有明显上升。CD105⁺小囊泡诱导转移效力明显比未分选的肿瘤细胞强（图9-7）。

小结：以上研究结果显示，肾癌细胞内小囊泡（MV）对肿瘤生长与浸润有促进作用，而肾癌干细胞来源的小囊泡的作用比肾癌细胞来源的小囊泡强。这些小囊泡能增强血管形成和建立肿瘤转移前的微环境，可能支持肿瘤不利的结果。

图9-8　小囊泡（MV）对肺癌转移形成的作用

结语

外泌体（exosomes）和小囊泡（microvesicle，MV）是由多种细胞经过“内吞—融合—外排”等一系列调控过程而形成的细胞外小囊泡。两者在很多情况下被混淆，其主要区别在于形成方式不同，外泌体是由多种活细胞产生的膜性小囊泡，它是来自于细胞的内涵体与胞膜融合，排出体外，即外泌体。小囊体是从细胞膜表面直接以出芽的方式产生。外泌体和小囊体在结构与功能方面很相似。

外泌体的外膜成分主要是蛋白和脂质，其内包含来源细胞的某些蛋白和mRNA 成分，不同类型细胞来源的外泌体组成不同，它可以将外泌体供体细胞的重要生物学特性传递到另一种细胞中，导致受体细胞表现出与外泌体供体细胞相似的一些生物学特性，从而在细胞信息传递过程中发挥重要作用。

外泌体作为肿瘤微环境中的一个重要组成部分，可能参与了肿瘤微环境中细胞间的信号转导以及肿瘤的发生和发展过程。外泌体可能通过调控免疫功能，促进肿瘤血管新生和肿瘤转移，以及直接作用于肿瘤细胞等途径，影响肿瘤的进展并在其中起着关键的作用。外泌体有可能成为继细胞因子之后肿瘤微环境研究中的又一个热点。

干细胞（stem cell，SC）来源的外泌体与小囊泡含有多种SC的特异性分子，这些具有“干细胞特性”的分子可通过外泌体与小囊泡作为载体，在细胞间进行传递，保证SC的自我更新和多项分化潜能。

随着人们对外泌体认识度的加深，其在临床诊断与治疗方面可能会展现出良好的前景。外泌体的肿瘤靶向治疗新方法，可能为肿瘤患者带来一种新的治疗选择。外泌体与小囊泡为一种非细胞成分，易获得，副作用小，免疫原性较弱，更易用于临床。目前存在的主要问题是如何找到快速、经济、高效的分离纯化外泌体的方法，克服现有提纯方法存在的缺点，这是外泌体与小囊泡应用于临床诊断和治疗的关键。

（陆士新）