第二节 microRNA与肿瘤干细胞
miRNA在肿瘤发生发展过程中，具有与癌基因或抑癌基因相似的作用。近年来，miRNA的研究发展迅速，随着研究不断深入，人们发现，许多miRNA参与了干细胞的自我更新与分化。如miR-302和miR-181能够促进肿瘤干细胞表型的形成；miR-203及miR-200家族成员起着调控肿瘤干细胞“干性”，促进肿瘤干细胞分化的作用； let-7能够调控乳腺癌干细胞的自我更新和分化；miR-145在人胚胎干细胞的自我更新过程中低表达，而在其分化过程中高表达，能够通过干细胞重编程因子（Oct4、Klf4）调控干细胞的数量（表5-1）。因此，miRNAs在肿瘤及肿瘤干细胞中的研究有望成为癌症治疗和临床研究的一种新策略。
miR-302基因簇是最早从小鼠胚胎干细胞及人胚胎干细胞中克隆出的miRNA，它在胚胎干细胞中高表达，但在细胞分化后表达迅速下调，且在成体细胞中不表达。miR-302基因簇的启动子受转录因子Oct4和Sox2的调控，在胚胎发育早期干细胞的全能性及其“干性”维持中必不可少。近来通过对调控细胞周期的关键蛋白Cyclin D1的研究发现，在人胚胎干细胞中，作用于G1期的细胞周期调控蛋白Cyclin D1是miR-302基因簇的作用靶点。miR-302的过表达可以促使肿瘤细胞向表达胚胎干细胞标记（如Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4、Sox2 和Nanog 基因）的胚胎样多潜能干细胞转变。因此，Oct4 /Sox2-miR-302-Cyclin D1信号通路在胚胎干细胞的多能性和自我更新中起着至关重要的作用。
通过下调同源蛋白Hox-A11（一种分化过程中的阻遏蛋白），miR-181在哺乳动物骨骼肌分化及重建骨骼表型过程中表达上调。研究发现，与未分化的祖细胞相比，miR-181a在B淋巴细胞中的表达上调，提示miR-181a是B淋巴细胞分化的正调节蛋白。相反，miR-181家族成员在肝癌细胞中的表达上调，尤其高表达于从α-甲胎蛋白（AFP）阳性肝癌组织中分离出的EpCAM 阳性肝癌干细胞或祖细胞。此外，研究还发现miR-181家族成员在胚胎肝脏组织和成体肝脏干细胞中的表达显著增高，通过调控肝癌细胞的分化（抑制GATA6和CDX2基因）和激活Wnt/β-catenin 信号通路（下调NLK基因）维持肝癌干细胞的“干性”。
在皮肤的形成过程中，miR-203是表皮细胞增殖和分化的开关。研究发现miR-203 可以抑制表皮干细胞的增殖潜能，通过抑制p63蛋白诱导细胞进入分裂周期，从而促进表皮细胞分化。在胰腺癌干细胞中，miR-203可以抑制肿瘤“干性”的维持，而miR-203自身又被ZEB1抑制，ZEB1是上皮-间质转化（EMT）的激活剂，也是胰腺癌及结直肠癌干细胞自我更新过程中必不可少的因素。因此，敲除ZEB1会使胰腺癌干细胞（CD24+/CD44+）减少，从而减少未分化的胰腺癌细胞系单克隆的形成，起到治疗胰腺癌的作用。
miR-200家族成员可以抑制人乳腺癌细胞的上皮化生，且受TGF-β的诱导。研究发现，miR-200的家族成员miR-200a、miR-200b 和miR-200c 在人乳腺癌干细胞、乳腺干/祖细胞、胚胎肿瘤细胞中的表达均较低。此外，有研究报道miR-200c 可抑制正常乳腺干细胞分化成乳腺导管或肿瘤细胞，也可抑制胰腺癌干细胞和乳腺癌干细胞“干性”的维持。
研究发现let-7在胚胎期、L1及L2期中不表达，在L3期的早期阶段低表达，在L4期和成体中表达增高。几个异时性基因，如lin-41 和daf-12 被认为是let-7的靶点。let-7家族成员广泛表达于小鼠和人的成体组织中，成熟的let-7 家庭成员在人和小鼠的胚胎干细胞及多能干细胞中不表达，而在其分化过程中表达增加。let-7 可以抑制多种重要的细胞周期调控基因的表达，如 Cyclin D1、Cyclin D3、Cyclin A、CDK4、CCNA2、CDC25A、CDK6、CDK8，其表达的异常会导致肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生。let-7过表达可以抑制Ras、HMGA等癌基因的表达，从而阻止细胞周期的进程，导致肿瘤细胞的形成。乳腺癌干细胞中let-7的过表达可以减少细胞的分化和单克隆细胞团的形成。因此，增加乳腺癌干细胞中let-7的表达水平会干扰肿瘤的发生和自我更新能力，降低let-7的表达能够维持乳腺癌干细胞的未分化状态和单克隆细胞团的增殖潜力。
miR-145是肿瘤抑制基因，研究发现miR-145在人胚胎干细胞的自我更新过程中的表达较低，在细胞分化过程中的表达上调，Oct4、Sox2、Klf4 等多能性基因是miR-145的直接作用靶点，因此miR-145的过表达可抑制人胚胎干细胞的自我更新，并诱导其定向分化。此外，miR-145 也可以通过靶基因Klf4、肌钙蛋白、Elk-1 调控平滑肌细胞的分化，成为成纤维细胞的肌钙蛋白重编程中必不可少的因素。与miR-145 类似，miR-143 也可以促进分化、抑制平滑肌细胞增殖。
作为一种肿瘤抑制性的miRNAs，miR-199b在转移性髓母细胞瘤中表达缺失。miR-199b过表达能负调控肿瘤细胞的增殖，破坏脑肿瘤细胞株的致瘤能力。研究发现，miR-199b是Notch通路的转录因子HES1 的作用靶点，调控肿瘤干细胞的自我更新能力。因此，增强miR-199b的表达会抑制肿瘤干细胞的生长，减少髓母细胞瘤中干细胞样（CD133+）亚群的数量，导致小鼠小脑移植瘤模型内髓母细胞瘤的形成异常。
研究发现，体外miR-128的表达可以减少神经胶质瘤细胞的增殖，在体内能够抑制神经胶质瘤的生长，miR-128可能是神经母细胞瘤的阻遏剂。与正常脑组织相比，神经母细胞瘤标本中Bmi-1的表达显著上调，而miR-128表达下调，说明miR-128可能通过靶基因Bmi-1抑制脑胶质瘤的增殖及自我更新能力。
在淋巴细胞性白血病肿瘤干细胞中，miR-17-19b表达明显上调，在动物实验中，miR-17-19b的上调能增加肿瘤干细胞的致瘤能力，加快白血病的进展，抑制肿瘤细胞的分化，并且通过靶向调控p21的表达来促进肿瘤细胞的增殖。MiR-17、miR-92在造血干细胞中高表达后，使Hedgehog信号通路被激活进而加速淋巴瘤的恶性进展。研究发现在白血病中miR-15和miR-16的表达水平升高，然而Bcl-2蛋白的表达却降低，说明这两种miRNA能调控靶基因Bcl-2的转录，从而诱导白血病细胞的凋亡。
乳腺癌中以CD44+、CD24-为表型分选出的肿瘤细胞，可以在无血清的培养液中聚集成球，这种表型的肿瘤细胞具有干细胞特性，被认为是乳腺癌的肿瘤干细胞。let-7在乳腺癌干细胞中表达水平明显降低，通过上调let-7能够抑制乳腺癌干细胞的增殖以及肿瘤的成球能力。进一步研究发现let-7能够降低Ras的表达，进而抑制乳腺癌干细胞的自我更新及增殖能力，但不影响分化。然而，let-7负调控HMGA2的表达促进细胞分化，但对自我更新无影响。表明let-7通过不同的靶基因影响肿瘤的生物学行为。对乳腺癌干细胞与癌旁正常组织细胞进行miRNA差异分析时发现，miR-200家族的miR-200a、miR-200b、miR-429、miR-200c和miR-141下调明显。其中miR-200c可以负向调节Bmi-1（干细胞自我更新的调控因子），从而使肿瘤细胞丧失增殖和自我更新的能力。进一步的研究中miR-200c能够明显阻止正常乳腺干细胞向乳腺导管的分化，体内实验中明显降低乳腺癌干细胞致瘤能力，可见miR-200c在正常干细胞和乳腺癌干细胞中起到纽带作用。在乳腺癌肿瘤细胞中还发现miR-214的等位基因缺失，且在肿瘤细胞中miR-214与胚胎干细胞中的Zeste基因增强子同源物2（Ezh2）呈负向相关，增加miR-214 可以降低Ezh2的mRNA的表达，进而抑制乳腺癌干细胞的分化。MiR-495在乳腺癌干细胞中显著上调，可以促进肿瘤干细胞的成球能力和肿瘤的形成。MiR-495以E-cadherin为靶点并抑制其表达从而促进细胞侵袭，通过抑制DNA损伤反应调节基因1（REDD1）及细胞增殖，加强细胞分化。这表明miR-495起到致癌基因的作用，调控肿瘤干细胞并促进肿瘤生长。
脑肿瘤的肿瘤干细胞常以CD133作为分选标志物，研究发现多种脑肿瘤的肿瘤干细胞中存在miRNA的异常表达。在胶质瘤CD133+细胞中miR-145的表达水平明显下调，将miR-145 转染入CD133+细胞后抗凋亡基因（Bcl-xL、Bcl-2）以及耐药基因（MDR1、ABCB5、ABCG2）表达下降，Bax基因表达增高；体内外实验中miR-145 能够抑制裸鼠体内CD133+细胞所致肿瘤的生长，能够提高放疗和化疗的疗效。将人恶性胶质细胞瘤干细胞与鼠少突胶质细胞瘤干细胞以及正常成年鼠神经干细胞相对比检测miRNA的差异表达，miR-124和miR-137在胶质瘤干细胞的表达水平明显下降，将肿瘤干细胞中miR-124和miR-137升高，使细胞周期停滞于G1期，这说明与细胞周期蛋白依赖激酶CDK6水平降低相关。在髓母细胞瘤的研究中，肿瘤干细胞中miR-199b-5p的表达水平明显降低，通过Notch2和Shh信号通路导致HES1表达增加，进而促进细胞增殖。当增加miR-199b -5p的水平时可负向调控HES1基因的表达，产生与上述相反的效果。
在结、直肠癌中，miR-135a和miR-136b表达升高导致β-catenin上调进而激活Wnt信号通路，促进结、直肠癌肿瘤干细胞的自我更新能力和肿瘤形成。对结肠癌化疗药物的耐药研究中，miR-215能够阻滞细胞周期G2期，进而抑制细胞增殖，从而增强了肿瘤对雷替曲塞和氨甲蝶呤的耐药性，CD133+CD44+HI与CD133+CD44+结肠癌干细胞对照，miR-215表达升高3倍以上，说明miR-215与结肠癌干细胞的化疗耐药相关。
在前列腺癌干细胞中，通常以CD44来作为干细胞分选的标志物。miR-34a可以通过结合CD44 mRNA的3′UTR来抑制CD44的表达，从而影响CD44阳性的前列腺癌干细胞的迁移和侵袭转移的能力。还有报道显示miR-34a可以抑制Notch和AR信号通路，从而影响前列腺癌干细胞的自我更新能力。miR-320可以直接调控β-catenin的表达来影响前列腺癌干细胞的特性。miR-320的高表达可以抑制Wnt/β-catenin信号通路，并且下调前列腺癌干细胞标志物的表达。
在食管癌干细胞中，侧群（side population，SP）细胞流式分离干细胞的方法应用较为广泛。研究发现，miR-203能通过调控Bmi-1来调控食管癌干细胞的自我更新和增殖。miR-203在食管癌干细胞中高表达，且在食管癌干细胞分化的过程中，miR-203的表达水平逐渐上升。在食管癌细胞系中高表达miR-203可以降低SP细胞的比例，降低细胞体外成克隆能力，增加对化疗药物的敏感性，降低裸鼠体内的致瘤能力。研究还显示，在食管癌干细胞中，miR-203可以调控干细胞关键分子Bmi-1的表达。在过表达miR-203的细胞中重新表达外源的Bmi-1蛋白后，可以恢复SP细胞比例和细胞的增殖能力。
在肺癌中与正常组织相比let-7表达水平降低，RAS蛋白在肺癌中却明显升高，说明let-7与下游靶基因H-RAS负相关进而调控肿瘤干细胞的自我更新以及肿瘤分化。let-7还能够与高迁移率蛋白A2（HMGA2）的3′UTR相结合，从而阻止HMGA2的进一步表达。3′UTR的突变将导致let-7无法与结合位点相结合，使HMGA2高表达，最终导致肿瘤细胞增殖。还发现miR-145、miR-25、miR-142-3P、miR-106a、miR-451等在肺癌干细胞中高表达，其中miR-145作为抑癌基因，下调OCT4基因表达，抑制肿瘤干细胞的增殖和多能性。
结语
肿瘤干细胞研究为肿瘤发生发展的机制和肿瘤治疗提供了重要的理论依据，而目前对miRNA的认识也已取得了很大的进展，大量新的miRNA被发现，对miRNA作用机制和一些基因的功能都有了较全面的认识。将这两个研究领域相结合，可以为肿瘤干细胞自我更新和增殖调控机制带来新的契机。从目前的研究来看，miRNA极有可能调控了肿瘤干细胞自我更新和分化之间的平衡关系，从而维持肿瘤的发生发展能力。我们相信，随着研究的深入，miRNA可以为人类肿瘤的预防和治疗开辟新的领域。
（余茜颖）