第三节　蛋白质的理化性质

蛋白质由氨基酸组成，且保留着游离的α-氨基、α-羧基以及侧链上的各种功能基团，因此某些理化性质与氨基酸相同，如两性解离、茚三酮反应和紫外吸收等。但蛋白质又是由许多氨基酸组成的高分子化合物，故又表现出与氨基酸不同的理化性质，如胶体性质、变性等。利用这些理化性质可对蛋白质进行分离、纯化。

一、蛋白质的两性解离性质

（一）两性解离和等电点

蛋白质和氨基酸一样具有两性解离性质。蛋白质分子中除两末端的氨基和羧基可解离外，侧链中也含有可解离的氨基和羧基，如赖氨酸残基的ε-氨基、组氨酸残基的咪唑基、精氨酸残基的胍基、谷氨酸和天冬氨酸残基的γ-和β-羧基等。这些基团在一定的pH条件下，可带正电荷或负电荷。蛋白质颗粒在溶液中所带的电荷取决于分子中碱性和酸性氨基酸的数量和溶液的pH。当蛋白质处于某一溶液的pH时，蛋白质游离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）。当pH＞pI时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则带正电荷。不同蛋白质由于所含的碱性氨基酸和酸性氨基酸的数目不同，等电点也不同。

凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏碱性，称为碱性蛋白质，如组蛋白、精蛋白等。反之，凡酸性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点就偏酸性，称为酸性蛋白质，如胃蛋白酶、丝蛋白等。人体内大多数蛋白质的等电点在5.0左右，所以在体液pH 7.4环境下，这些蛋白质均带有负电荷。

（二）基于两性解离和等电点性质的分离、纯化技术

蛋白质具有两性解离性质，在一定pH条件下成为带电颗粒，利用这一特性，可将混合蛋白质通过电泳、离子交换或层析的方法进行分离和纯化。

1.蛋白质电泳技术

在一定的pH条件下，不同的蛋白质分子其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不相同。利用蛋白质这一性质将不同蛋白质从混合液中分离出来的技术称为蛋白质电泳技术（electrophoresis）。常见的蛋白质电泳技术有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹杂交技术和双向凝胶电泳等，可用于蛋白质的分离、纯化鉴定、分子量测定和蛋白质组学研究。

2.离子交换层析

氨基酸、蛋白质等大多是两性物质，在水溶液中带有电荷。由于生物分子自身的性质差异，造成了在特定的介质中所带的电荷种类和密度不同。离子交换层析（ion exchange chromatography）就是利用离子交换剂上的阴离子或阳离子与被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离目的的一种柱层析法。该法具有灵敏度高、重复性、选择性好、分离速度快等优点，是当前最常用的层析法之一，常用于蛋白质、氨基酸及多肽等多种离子型生物分子的分离、纯化。

二、蛋白质的胶体性质

蛋白质是高分子化合物，其分子质量介于一万到百万之间，分子直径可达1～100nm，在水溶液中具有胶体溶液的各种性质。蛋白质的表面带有许多亲水极性基团，如—、—COO-、—SH 和—OH- 等。这些基团具有强烈地吸引水分子的作用，使蛋白质分子表面形成一层水化膜。蛋白质分子表面的水化膜和极性基团解离产生的同种电荷（同种电荷排斥），可以使蛋白质颗粒相互隔开，阻止蛋白质颗粒的相互聚集和从溶液中沉淀析出。因此，水化膜和表面电荷是维持蛋白质胶体性质的两个最重要稳定因素（图2-25）。

三、蛋白质的变性、凝固和沉淀

（一）蛋白质变性

在某些物理或化学因素作用下，蛋白质特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质改变和生物活性丧失，这种现象称为蛋白质变性（denaturation）。

引起蛋白质变性的因素有强酸、强碱、有机溶剂、尿素、去污剂（十二烷基硫酸钠，SDS）、重金属离子等化学因素和高热、高压、超声波、紫外线、X射线等物理因素。蛋白质变性的实质是次级键断裂，空间结构被破坏，但不涉及肽键连接的氨基酸序列的改变，即一级结构仍然存在。蛋白质变性后理化性质和生物学功能发生改变，主要表现为溶解度降低、易于沉淀、结晶能力消失、黏度增加、生物活性丧失和易被蛋白酶水解等。

大多数蛋白质变性后，空间构象严重破坏，不能恢复其天然状态，称为不可逆性变性；若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，仍可恢复其原有天然构象和功能，这一现象称为蛋白质复性。例如，牛核糖核酸酶在尿素和β-巯基乙醇作用下变性后，透析去除尿素和β-巯基乙醇又可恢复其空间构象及酶的活性。蛋白质变性在医学上具有重要的实际应用价值，如消毒灭菌和保存生物制品等。

（二）蛋白质凝固

天然蛋白质或等电点状态的变性蛋白质经加热煮沸，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。这种现象称为蛋白质凝固作用。如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都是蛋白质凝固的典型例子。

（三）蛋白质沉淀

蛋白质胶粒在物理、化学因素作用下失去水化膜和分子表面电荷就会发生沉淀。使蛋白质沉淀的方法有盐析法、有机溶剂、重金属盐及生物碱试剂的沉淀等。变性的蛋白质易于沉淀，但不一定都发生沉淀。当溶液的pH值接近其等电点时，变性的蛋白质则聚集而沉淀。而溶液的pH值远离其等电点时，蛋白质可不产生沉淀。沉淀的蛋白质易发生变性，但并不都变性，如盐析。

蛋白质变性、沉淀、凝固相互之间有很密切的关系。沉淀蛋白质并不一定变性，变性蛋白质易沉淀，凝固的蛋白质均已变性，且不再溶解。凝固实际上是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。例如，蛋白质被强酸、强碱变性后由于蛋白质颗粒带着大量电荷，故仍溶于强酸或强碱中。但若将强碱和强酸溶液的pH调节到等电点，则变性蛋白质凝集成絮状沉淀物，若将此絮状物加热，则分子间相互盘缠而变成较为坚固的凝块。

四、蛋白质的紫外吸收性质

蛋白质分子中含有具有共轭双键的酪氨酸和色氨酸残基，这些氨基酸的侧链基团具有紫外吸收能力，在280nm波长附近有特征性吸收峰。在此范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比。因此可利用蛋白质的这一特点，对蛋白质进行定量测定。

五、蛋白质的呈色反应

蛋白质分子中的肽键及某些氨基酸残基的化学基团，可与某些化学试剂发生呈色反应。利用这些呈色反应可以对蛋白质进行定性、定量测定（表2-3）。

1.茚三酮反应

同氨基酸一样，蛋白质分子中的α-游离氨基可以与茚三酮反应，生成蓝紫色化合物。

2.双缩脲反应

双缩脲是两分子脲加热产氨缩合的产物。在稀碱溶液中，肽键与硫酸铜共热形成络合盐，呈现紫色或粉红色的反应。蛋白质和多肽分子中含有两个以上的肽键，也能发生此呈色反应，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而氨基酸无此反应。临床检验中常用双缩脲法测定血清总蛋白、血浆纤维蛋白原的含量，灵敏度可以达到1～20mg。

3.酚试剂反应

蛋白质分子中色氨酸和酪氨酸的酚羟基可以将酚试剂中的磷钨酸-钼酸还原，生成蓝色化合物。酚试剂反应是最为常用的蛋白质定量检测方法。此反应的灵敏度比双缩脲反应高100倍，比紫外分光光度法高10～20倍。常用于测定一些微量蛋白质的含量（约5μg），如血清黏蛋白、脑脊液中蛋白质等。

（王　杰）